Что такое микроскопия? Техническое руководство по микроскопии.

1. Что такое микроскопия?

Микроскопия — это наука и практика использования микроскопов для наблюдения за объектами и структурами, слишком малыми для того, чтобы их можно было увидеть невооруженным глазом. От самых ранних примитивных увеличительных линз, созданных в Европе в XVII веке, до современных передовых систем сверхвысокого разрешения и электронной микроскопии, микроскопия оставалась краеугольным камнем научных открытий, позволяя совершать революционные прорывы в биологии, медицине, материаловедении, производстве полупроводников, криминалистике и других областях.

Человеческий глаз способен различать детали размером не менее примерно 100 микрометров (мкм). Микроскопия расширяет эти возможности на порядки, позволяя ученым и инженерам наблюдать отдельные клетки, субклеточные органеллы, кристаллические решетки, наноразмерные дефекты поверхности и даже отдельные молекулы. Таким образом, она переопределила границы того, что можно познать в науке и чего можно достичь в промышленности.

Однако по своей сути микроскопия — это разрешение деталей, получение тонкой пространственной информации с четкостью, точностью и воспроизводимостью. И качество этих деталей зависит, прежде всего, от оптических компонентов, лежащих в основе системы, особенно от объектива.

2. Как работает микроскоп?

Современный составной микроскоп работает по принципу многоступенчатого увеличения с помощью ряда точно спроектированных оптических элементов. Свет от источника освещения — или излучаемый самим образцом в случае флуоресценции — проходит через объектив , который захватывает и фокусирует его, создавая увеличенное действительное изображение. Затем это изображение либо рассматривается через окуляр для непосредственного наблюдения, либо передается на датчик цифровой камеры через тубусный объектив для захвата, анализа и архивирования.

2.1 Объектив

Основной оптический элемент расположен ближе всего к образцу. Он определяет разрешение системы, увеличение, глубину резкости и эффективность сбора света. Это, без сомнения, наиболее важный компонент во всем микроскопе.

2.2 Трубчатая линза

Линза тубуса работает в паре с объективом с коррекцией на бесконечность, чтобы свести коллимированные лучи, выходящие из объектива, в сфокусированное промежуточное изображение. Она играет жизненно важную роль в минимизации оптических аберраций и обеспечении резкости и геометрической точности изображения, проецируемого на датчик или окуляр.

2.3 Окуляр или датчик камеры

Окуляр или датчик камеры передает окончательное изображение наблюдателю или детектору. В научных и промышленных условиях практически повсеместно используются цифровые камеры, позволяющие обрабатывать изображения, проводить количественный анализ и архивировать данные.

2.4 Система освещения

Независимо от того, используется ли проходящий, отраженный, лазерный или светодиодный источник света, его необходимо тщательно согласовывать со спектральной чувствительностью объектива и используемым методом визуализации.

Понимание физических и инженерных принципов работы каждого из этих компонентов имеет важное значение для выбора правильной конфигурации микроскопа для конкретного применения и для уверенной интерпретации получаемых изображений.

3. Ключевые оптические параметры в микроскопии

Для принятия обоснованных решений относительно микроскопических систем и компонентов специалистам необходимо понимать основные оптические параметры, определяющие их производительность.

3.1 Числовая апертура

Числовая апертура (NA) — пожалуй, наиболее важная характеристика в микроскопии. Это безразмерное число, определяющее диапазон углов, в которых объектив может принимать или излучать свет, и оно напрямую влияет как на разрешение, так и на светособирающую способность. Теоретический предел разрешения объектива определяется критерием Рэлея: Разрешение (мкм) = 0.61 × λ / NA, где λ — длина волны используемого света. Более высокое значение NA позволяет различать более мелкие детали. Например, объектив с NA = 0.90, работающий на видимом свете с длиной волны 550 нм, теоретически может различать детали размером примерно 0.37 мкм. На практике NA также определяет эффективность сбора флуоресцентного сигнала или рассеянного света — критически важный фактор в приложениях для визуализации при слабом освещении.

3.2 Рабочее расстояние

Рабочее расстояние (РР) — это физический зазор между передним линзовым элементом объектива и фокальной плоскостью образца, когда образец находится в резком фокусе. Этот параметр имеет огромное практическое значение. Объективы с большим увеличением и высокой числовой апертурой (NA) обычно имеют очень короткое рабочее расстояние — иногда менее 1 мм — что ограничивает доступ к образцу и накладывает ограничения на конструкцию держателей образцов. В отличие от них, объективы с большим рабочим расстоянием (LWD) жертвуют некоторой числовой апертурой в обмен на больший зазор, что позволяет получать изображения через толстые подложки, климатические камеры или промышленные ограждения.

3.3 Глубина резкости

Глубина резкости (DOF) определяет осевой диапазон, в котором образец остается в приемлемой фокусировке. Она обратно пропорциональна квадрату числовой апертуры (NA) — это означает, что с увеличением NA глубина резкости быстро уменьшается. Для объектива с высокой числовой апертурой (NA = 0.90) глубина резкости может составлять лишь доли микрометра. Это требует чрезвычайно точного осевого позиционирования образца, обычно достигаемого с помощью моторизованных Z-позиционеров с разрешением менее микрометра.

3.4 Поле зрения (FOV)

Поле зрения (FOV) определяет боковые границы образца, которые можно отобразить в одном кадре. При малом увеличении (например, 1X) объектив может охватывать все поле размером 24 мм. При 100X это поле сужается до менее чем 0.25 мм. Баланс между полем зрения и разрешением является фундаментальным компромиссом в проектировании микроскопов: большое увеличение обеспечивает детализацию в небольшой области, в то время как малое увеличение позволяет исследовать большую область с пониженным разрешением. Во многих рабочих процессах используется комбинация увеличений — малое увеличение для общего обзора, большое увеличение для детального исследования.

3.5 Хроматическая и сферическая аберрация

Хроматическая аберрация приводит к тому, что свет разных длин волн фокусируется в разных осевых положениях, вызывая цветовые искажения и размытие в широкополосной визуализации. Сферическая аберрация возникает, когда лучи, проходящие через разные радиальные зоны линзы, фокусируются в разных точках. Разработка объектива в значительной степени сводится к коррекции этих аберраций в соответствующем спектральном диапазоне — задача, которая определяет разницу между ахроматическими, полуапохроматическими и полностью апохроматическими объективами.

4. Виды микроскопии

Микроскопия — это не одна методика, а широкое семейство методов, каждый из которых адаптирован к определенным типам образцов, механизмам контрастирования и требованиям к получаемой информации.

4.1 Световая микроскопия

Это наиболее широко используемый и исторически старейший вид оптической микроскопии. Образец освещается проходящим или отраженным белым светом, а контраст возникает за счет поглощения, рассеяния или отражения этого света образцом. Он хорошо подходит для окрашивания биологических срезов тканей, непрозрачных промышленных материалов и рутинного контроля качества.

4.2 Флуоресцентная микроскопия

Образцы для флуоресцентной микроскопии метятся флуоресцентными красителями или генетически кодированными флуоресцентными белками, которые возбуждаются светом определенной длины волны и излучают свет на большей длине волны. Используя соответствующие фильтры возбуждения и излучения, можно одновременно визуализировать несколько флуоресцентных меток, что позволяет с исключительной точностью выявлять пространственную организацию белков, нуклеиновых кислот, липидов и органелл. Используемые объективы должны обладать минимальной автофлуоресценцией и высокой пропускающей способностью в диапазоне длин волн от УФ до ближнего инфракрасного излучения.

4.3 Конфокальная микроскопия

Диафрагма с точечным отверстием, сопряженная с фокальной плоскостью, физически блокирует попадание нефокусированного флуоресцентного излучения на детектор, что позволяет проводить оптическое секционирование — получение четких, высококонтрастных изображений на заданной глубине внутри трехмерного образца. Собирая стопку оптических срезов в разных положениях по оси Z, можно собрать полную трехмерную реконструкцию. Конфокальная микроскопия широко используется в нейробиологии, биологии развития, исследованиях рака и анализе полупроводниковых материалов.

4.4 Микроскопия с дифференциальным интерференционным контрастом (ДИК)

Метод DIC использует поляризованный свет и призму Номарского для получения псевдотрехмерных изображений прозрачных неокрашенных образцов — таких как живые клетки, эмбрионы или оптически гладкие поверхности — выявляя топологию поверхности и внутренние изменения показателя преломления с исключительной чувствительностью. Он особенно ценен для визуализации живых клеток, где флуоресцентная маркировка нежелательна или непрактична.

4.5 Микроскопия ближнего инфракрасного диапазона (БИК)

Он работает в диапазоне длин волн приблизительно от 700 нм до 1,100 нм. Кремний, который непрозрачен в видимом диапазоне, становится прозрачным в этом диапазоне, что делает ИК-микроскопию незаменимой для контроля обратной стороны кремниевых полупроводниковых устройств. ИК-микроскопия также используется для визуализации глубоких тканей в биомедицинских приложениях, где более длинные волны рассеивают меньше и позволяют получить изображение на большей глубине.

4.6 Микроскопия в ближнем ультрафиолетовом диапазоне (БУФ)

Работая в диапазоне длин волн от 355 нм до 405 нм, микроскопия в ближнем ультрафиолетовом диапазоне обеспечивает более высокое пространственное разрешение, чем системы видимого света, и широко используется в контроле фотошаблонов, мониторинге процессов микроизготовления с помощью УФ-лазера и полупроводниковой литографии.

4.7 Микроскопия сверхвысокого разрешения

Микроскопия сверхвысокого разрешения, включающая такие методы, как STED, STORM и PALM, позволяет обойти классический дифракционный предел и достичь пространственного разрешения в десятки нанометров. Эти методы предъявляют чрезвычайно высокие требования к качеству объективов , особенно в отношении числовой апертуры (NA), коррекции аберраций и эффективности пропускания.

5. Роль объектива

Объектив — это оптическое сердце любого микроскопа, место, где свет наиболее критически взаимодействует с образцом и где устанавливаются фундаментальные пределы разрешения и контраста. Выбор неправильного объектива приводит к размытым изображениям, низкому соотношению сигнал/шум, хроматическим артефактам и потере информации.

5.1 Апохроматическая коррекция

Апохроматические (АПО) объективы корректируются на трех или более длинах волн, обеспечивая плоские, резкие и цветоточные изображения во всем интересующем спектральном диапазоне. Это крайне важно для многоканальной флуоресцентной визуализации, где одновременное или последовательное получение изображений в нескольких диапазонах длин волн должно обеспечивать совмещенные изображения без хроматического смещения.

5.2 Оптическая схема с коррекцией на бесконечность

В системе с коррекцией на бесконечность объектив формирует коллимированный луч между собой и линзой тубуса. Это промежуточное коллимированное пространство позволяет устанавливать светоделители, фильтры, волноводы и другие оптические компоненты, не нарушая фокусировку — это важное требование для сложных конфигураций, таких как флуоресцентные фильтрующие кубы, системы доставки лазерного излучения и поляризационная оптика.

6. Wavelength Opto-Electronic Объективы микроскопа

Для исследователей, инженеров и системных интеграторов, которым необходима точность на каждом уровне, Wavelength Opto-Electronic предлагает широкий ассортимент из более чем 40 микроскопов. объективы Разработаны для самых строгих научных и промышленных применений. Каждый объектив в линейке представляет собой апохроматическую систему с коррекцией на бесконечность, доступную в видимом, ближнем инфракрасном и ультрафиолетовом диапазонах спектра.

6.1 Серия M-PlanAPO — Апохроматические объективы с коррекцией на бесконечность

Обеспечивает апохроматическую коррекцию в видимом спектре 400–700 нм при увеличении от 1X до 50X, с числовой апертурой от 0.025 до 0.550. Идеально подходит для мониторинга коаксиальной лазерной обработки в реальном времени, микроизображения, DIC-изображения, флуоресцентного контроля в биомедицинских исследованиях, а также для точного лазерного ремонта сенсорных панелей и солнечных элементов.

6.2 Серия M-PlanAPO-HR — Объективы высокого разрешения

Повышает производительность еще больше: числовая апертура достигает 0.900 при 100-кратном увеличении, а разрешение составляет всего 0.30 мкм. Идеальный выбор для применений, где максимальная пространственная детализация является обязательной, включая усовершенствованную инспекцию полупроводников, наноразмерную метрологию поверхностей и высокопроизводительный флуоресцентный скрининг.

6.3 Серия M-PlanAPO-SL — Объективы со сверхдальним рабочим расстоянием

Предназначены для применений, где критически важен физический зазор между объективом и образцом. Благодаря рабочему расстоянию до 30 мм при 20-кратном увеличении, серия SL позволяет получать изображения через климатические камеры, нагреваемые столики, микрофлюидные устройства или специально разработанные промышленные корпуса без ущерба для оптического качества.

6.4 Серия объективов для ближнего инфракрасного диапазона — оптимизирована для инфракрасного излучения

Оптимизированный для длин волн 532 нм и 1030–1064 нм, специально разработан для контроля обратной стороны кремниевых пластин, флуоресцентной визуализации в ближнем инфракрасном диапазоне и микроизготовления с использованием фемтосекундных лазеров. M-PlanAPO-HRNIR-50X обеспечивает впечатляющую числовую апертуру 0.750 при рабочем расстоянии 4 мм, предлагая исключительное разрешение для обработки с помощью ближнего инфракрасного лазера.

6.5 NUV Объективы серии NUV — оптимизированы для ультрафиолетового излучения

Поддерживает длины волн 355 нм, 365 нм, 405 нм и 532 нм для контроля фотошаблонов в УФ-диапазоне, микроизготовления с использованием УФ-лазера и мониторинга полупроводниковой литографии. M-PlanAPO-HRNUV-50X обеспечивает числовую апертуру 0.650 при рабочем расстоянии 10 мм, сочетая высокое разрешение с удобным рабочим зазором.

6.6-дюймовый ЖК-дисплей серии PlanAPO — с коррекцией защитного стекла.

Предоставляет объективы для ближнего и ближнего ультрафиолетового диапазонов со встроенными опциями коррекции покровного стекла (t0, t0.7 и t1.1 мм), обеспечивая дифракционно-ограниченную производительность при визуализации через стандартные микроскопические покровные стекла — что крайне важно в биологических исследованиях, где образцы обычно размещаются под стеклянными покровными стеклами.

6.7 Серия PlanFluor-EPI — Окулярные объективы, оптимизированные для флуоресценции

Специально оптимизирован для эпи-освещенной флуоресцентной микроскопии, обеспечивая значения числовой апертуры до 0.90 при 100-кратном увеличении и поле зрения 25 мм. Доступен в вариантах резьбы W4/5″ и M26 x 0.706 для совместимости с широким спектром вертикальных и инвертированных флуоресцентных микроскопов.

6.8 TL-200-70 Тубусный объектив

Объектив TL-200-70 (EFL: 200 мм, WD: 60.36 мм), предназначенный для использования с любым из вышеперечисленных объективов с коррекцией на бесконечность, фокусирует коллимированный выходной луч в резкое, хорошо скорректированное промежуточное изображение с минимальными аберрациями, завершая оптическую систему.

Для OEM-заказчиков и научно-исследовательских учреждений, которым требуются нестандартные характеристики, доступна индивидуальная настройка всего ассортимента продукции, включая измененные рабочие расстояния, специальные покрытия, альтернативные форматы резьбы или полностью индивидуальные оптические конструкции. Свяжитесь с нами, чтобы обсудить ваши требования.

7. Выбор подходящего объектива

Выбор оптимальной цели требует тщательного сопоставления нескольких параметров с конкретным приложением и конструкцией системы.

7.1 Диапазон длин волн

Определите, работает ли ваше приложение в видимом, ближнем инфракрасном или ультрафиолетовом диапазоне, и выберите объектив, стекло и покрытия которого оптимизированы для этого диапазона.

7.2 Увеличение и числовая апертура

Более высокое увеличение и числовая апертура обеспечивают более высокое разрешение, но уменьшают поле зрения и рабочее расстояние. Сначала определите требуемое разрешение, а затем выберите минимальное увеличение, которое ему соответствует.

7.3 Рабочее расстояние

Оцените геометрию образца и держателя образца. Закрытые камеры, толстые подложки или промышленные установки обычно требуют вариантов с большим рабочим расстоянием.

7.4 Коррекция защитного стекла

При визуализации через покровное стекло используйте корректирующий объектив серии LCD, подобранный по толщине покровного стекла, чтобы избежать ухудшения качества изображения, вызванного сферической аберрацией.

7.5 Среда приложения

Следует учитывать, будет ли объектив использоваться в чистой лаборатории, на промышленной производственной линии или на рабочей станции лазерной обработки, поскольку это влияет на требуемую механическую прочность и устойчивость к загрязнениям.

8. Применение прецизионной микроскопии

8.1 Биомедицинские и биологические науки

Апохроматические объективы с высокой числовой апертурой являются стандартным инструментом для клеточной биологии, патологии, геномики и разработки фармацевтических препаратов. Многоканальная флуоресцентная и конфокальная микроскопия с использованием серий M-PlanAPO и PlanFluor-EPI поддерживает самые сложные рабочие процессы биологической визуализации.

8.2 Контроль полупроводников и кремниевых пластин

Объективы ближнего инфракрасного диапазона (NIR) позволяют проводить инспекцию обратной стороны кремниевых устройств на длине волны 1064 нм, где кремний прозрачен, — выявляя скрытые межсоединения, пустоты и дефекты, невидимые для систем видимого света. Серии M-PlanAPO-NIR и HRNIR специально разработаны для этого применения.

8.3 Лазерная микрообработка и производство

Для высокоточной лазерной резки, сверления, сварки и структурирования поверхностей в микромасштабе требуются объективы с узкой фокусировкой луча, большим рабочим расстоянием и высоким порогом лазерного повреждения. Серии M-PlanAPO-SL и NIR оптимизированы для коаксиальной подачи лазерного излучения и мониторинга процесса в реальном времени.

8.4 Анализ правовых и исторических документов

Объективы с большим рабочим расстоянием и возможностями съемки в видимом и ближнем инфракрасном диапазоне позволяют бесконтактно получать изображения хрупких исторических документов, произведений искусства и криминалистических доказательств, выявляя скрытый текст, состав чернил и следы подделок без физического контакта и риска повреждения.

8.5 Медицинская оптическая визуализация

От эндоскопии до офтальмологии и хирургического сопровождения — точность. объективы обеспечить высокоразрешающую визуализацию in vivo с использованием различных медицинских методов. Wavelength Opto-ElectronicОбъективный диапазон соответствует оптическим требованиям различных архитектур медицинских систем визуализации.

9. Заключение

Микроскопия — это гораздо больше, чем просто увеличение. Это наука о том, как видеть четко — с точностью, в масштабе и в широком спектре длин волн — и преобразовывать увиденное в знания и возможности. Каждое достижение в микроскопии открывало новые горизонты в физическом мире, от открытия клетки до визуализации отдельных атомов, от исследования наноразмерных транзисторов до визуализации живой нейронной активности.

Он остается определяющим оптическим элементом в этом деле. Его числовая апертура устанавливает предел разрешения. Его спектральная коррекция определяет хроматическую точность. Его рабочее расстояние определяет, какие образцы и конфигурации доступны. А его коррекция аберраций отделяет данные, пригодные для публикации, от шума, изобилующего артефактами.

Независимо от того, создаете ли вы платформу для флуоресцентной визуализации в биологических науках, систему контроля качества полупроводников в ближнем инфракрасном диапазоне или рабочую станцию ​​для обработки УФ-лазером в высокоточном производстве, объектив Именно здесь решается судьба успеха или поражения. Wavelength Opto-ElectronicАссортимент продукции компании, насчитывающий более 40 объективов для микроскопов — охватывающих видимый, ближний инфракрасный и ближний ультрафиолетовый спектральные диапазоны, в стандартном, высокоразрешающем, с большим рабочим расстоянием и с коррекцией покровным стеклом — обеспечивает оптическую основу для самых сложных задач микроскопии в научных исследованиях и промышленности.