Kas yra mikroskopija? Techninis mikroskopijos vadovas

1. Kas yra mikroskopija?

Mikroskopija – tai mokslas ir praktika, kai mikroskopais stebimi objektai ir struktūros, per maži, kad juos būtų galima matyti plika akimi. Nuo pirmųjų elementarių didinamųjų lęšių, sukurtų XVII amžiaus Europoje, iki šių dienų pažangiausių itin didelės skiriamosios gebos ir elektroninės mikroskopijos sistemų mikroskopija buvo mokslinių atradimų kertinis akmuo, sudaręs sąlygas transformaciniams proveržiams biologijoje, medicinoje, medžiagų moksle, puslaidininkių gamyboje, teismo ekspertizėje ir kitose srityse.

Žmogaus akis gali atskirti darinius, ne mažesnius nei maždaug 100 mikrometrų (µm). Mikroskopija išplečia šias galimybes keliais dydžio eilėmis, suteikdama mokslininkams ir inžinieriams galimybę stebėti atskiras ląsteles, subląstelines organeles, kristalinės gardelės struktūras, nanoskalės paviršiaus defektus ir net pavienes molekules. Taip iš naujo apibrėždamos mokslo žinomumo ir pramonės pasiekiamumo ribas.

Tačiau iš esmės mikroskopija yra skirta detalių išskyrimui – tiksliam, aiškiam ir atkuriamam tikslios erdvinės informacijos fiksavimui. O tų detalių kokybė labiausiai priklauso nuo sistemos centre esančių optinių komponentų, ypač objektyvo.

2. Kaip veikia mikroskopas?

Šiuolaikinis sudėtinis mikroskopas veikia daugiapakopio didinimo principu, naudojant tiksliai sukonstruotų optinių elementų seriją. Šviesa iš apšvietimo šaltinio – arba paties bandinio skleidžiama fluorescencijos atveju – praeina pro objektyvinį lęšį , kuris ją fiksuoja ir sufokusuoja, kad būtų sukurtas padidintas tikrasis vaizdas. Tada šis vaizdas yra peržiūrimas per okuliarą tiesioginiam stebėjimui arba perduodamas į skaitmeninio fotoaparato jutiklį per vamzdinį lęšį, kad būtų galima jį užfiksuoti, analizuoti ir archyvuoti.

2.1 Objektyvas

Pirminis optinis elementas yra arčiausiai mėginio. Jis lemia sistemos skiriamąją gebą, didinimą, lauko gylį ir šviesos surinkimo efektyvumą. Be jokios abejonės, tai yra svarbiausias viso mikroskopo komponentas.

2.2 Vamzdinis lęšis

Vamzdinis lęšis veikia kartu su begalybės korekcijos objektyvu, kad sujungtų iš objektyvo sklindančius kolimuotus spindulius į sufokusuotą tarpinį vaizdą. Jis atlieka gyvybiškai svarbų vaidmenį mažinant optines aberacijas ir užtikrinant, kad ant jutiklio ar okuliaro projektuojamas vaizdas būtų ryškus ir geometriškai tikslus.

2.3 Okuliaras arba kameros jutiklis

Okuliaras arba kameros jutiklis perduoda galutinį vaizdą stebėtojui arba detektoriui. Mokslinių tyrimų ir pramonės aplinkoje skaitmeniniai fotoaparatai naudojami beveik visur, nes tai leidžia apdoroti vaizdus, ​​atlikti kiekybinę analizę ir archyvuoti duomenis.

2.4 Apšvietimo sistema

Nesvarbu, ar tai praleidžiamas, atspindėtas, lazerinis, ar LED pagrindu veikiantis metodas, jis turi būti kruopščiai suderintas su objektyvo spektriniu jautrumu ir naudojamu vaizdo gavimo būdu.

Norint pasirinkti tinkamą mikroskopijos konfigūraciją konkrečiai programai ir užtikrintai interpretuoti jos sukurtus vaizdus, ​​būtina suprasti kiekvieno iš šių komponentų fiziką ir inžineriją.

3. Pagrindiniai optiniai parametrai mikroskopijoje

Norėdami priimti pagrįstus sprendimus dėl mikroskopijos sistemų ir komponentų, specialistai turi suprasti pagrindinius optinius parametrus, kurie lemia jų veikimą.

3.1 Skaitmeninė diafragma

Skaitmeninė diafragma (NA) yra bene svarbiausia mikroskopijos specifikacija. Tai bematis skaičius, kuris kiekybiškai įvertina kampų diapazoną, kuriuo objektyvas gali priimti arba skleisti šviesą, ir tiesiogiai reguliuoja tiek skiriamąją gebą, tiek šviesos surinkimo galią. Teorinę objektyvo skiriamosios gebos ribą nurodo Rayleigh kriterijus: skiriamoji geba (µm) = 0.61 × λ / NA, kur λ yra naudojamos šviesos bangos ilgis. Didesnė NA leidžia išskirti smulkesnius darinius. Pavyzdžiui, objektyvas, kurio NA = 0.90, veikiantis esant 550 nm matomai šviesai, teoriškai gali išskirti net maždaug 0.37 µm dydžio darinius. Praktiškai NA taip pat lemia, kaip efektyviai sistema surenka fluorescencinį signalą arba išsklaidytą šviesą – tai labai svarbus aspektas vaizduojant prasto apšvietimo sąlygomis.

3.2 Darbinis atstumas

Darbinis atstumas (DA) – tai fizinis atstumas tarp objektyvo priekinio lęšio elemento ir mėginio židinio plokštumos, kai mėginys yra ryškiai sufokusuotas. Šis parametras yra nepaprastai svarbus praktiškai. Didelio didinimo objektyvai su dideliu NA paprastai turi labai trumpus darbinius atstumus – kartais mažesnius nei 1 mm, – o tai riboja prieigą prie mėginio ir varžo mėginių laikiklių konstrukciją. Priešingai, didelio darbinio atstumo (LWD) objektyvai sumažina NA, tačiau užtikrina didesnį atstumą, todėl galima vaizduoti per storus substratus, aplinkos kameras ar pramonines patalpas.

3.3 Lauko gylis

Lauko gylis (DOF) apibrėžia ašinį diapazoną, kuriame mėginys išlieka priimtinai sufokusuotas. Jis yra atvirkščiai proporcingas NA kvadratui – tai reiškia, kad didėjant NA, lauko gylis sparčiai mažėja. Esant didelio NA objektyvui, kai NA = 0.90, lauko gylis gali būti tik mikrometro dalis. Tam reikalingas itin tikslus mėginio ašinis pozicionavimas, kuris paprastai pasiekiamas naudojant motorizuotus z formos stakles su submikrometro skiriamąja geba.

3.4 Matymo laukas (FOV)

Regėjimo laukas (FOV) nustato mėginio šoninę apimtį, kurią galima nufotografuoti viename kadre. Esant mažam didinimui (pvz., 1X), objektyvas gali apimti visą 24 mm lauką. Esant 100X didinimui, šis laukas susiaurėja iki mažiau nei 0.25 mm. Regėjimo lauko ir skiriamosios gebos suderinimas yra esminis mikroskopijos projektavimo kompromisas: didelis didinimas leidžia gauti smulkias detales mažame plote, o mažas didinimas – apžiūrėti didesnį plotą mažesne skiriamąja geba. Daugelyje darbo eigų naudojamas didinimo derinys – mažas didinimas bendriniam skenavimui, didelis didinimas – detaliam patikrinimui.

3.5 Chromatinė ir sferinė aberacija

Chromatinė aberacija sukelia skirtingų šviesos bangos ilgių fokusavimą skirtingose ​​ašinėse pozicijose, todėl plačiajuosčio vaizdo gavimo metu atsiranda spalvų iškraipymas ir neryškumas. Sferinė aberacija atsiranda, kai spinduliai, einantys per skirtingas lęšio radialines zonas, sufokusuojasi skirtinguose taškuose. Objektyvo lęšio dizainas daugiausia yra šių aberacijų koregavimo pratimas atitinkamame spektriniame diapazone – užduotis, kuri apibrėžia skirtumą tarp achromatinių, pusiau apochromatinių ir visiškai apochromatinių objektyvų.

4. Mikroskopijos tipai

Mikroskopija nėra vienas metodas, o plati metodų grupė, kurių kiekvienas pritaikytas konkretiems mėginių tipams, kontrasto mechanizmams ir informacijos reikalavimams.

4.1 Ryškaus lauko mikroskopija

Tai plačiausiai naudojama ir istoriškai seniausia optinės mikroskopijos forma. Mėginys apšviečiamas praleidžiama arba atspindėta balta šviesa, o kontrastas atsiranda dėl mėginio sugerties, išsklaidymo arba tos šviesos atspindžio. Ji puikiai tinka dažytiems biologinių audinių pjūviams, neskaidrioms pramoninėms medžiagoms ir įprastinei kokybės kontrolei.

4.2 Fluorescencinė mikroskopija

Fluorescencinės mikroskopijos mėginiai žymimi fluorescenciniais dažais arba genetiškai užkoduotais fluorescenciniais baltymais, kurie sužadinami specifiniu šviesos bangos ilgiu ir spinduliuoja ilgesniu bangos ilgiu. Naudojant tinkamus sužadinimo ir emisijos filtrus, vienu metu galima vaizduoti kelias fluorescencines žymes, atskleidžiant baltymų, nukleorūgščių, lipidų ir organelių erdvinę organizaciją su ypatingu specifiškumu. Čia naudojami objektyviniai lęšiai turi pasižymėti minimaliu autofluorescencija ir dideliu pralaidumu UV–NIR bangos ilgiuose.

4.3 Konfokalinė mikroskopija

Židinio plokštumoje konjuguota adatinė anga fiziškai blokuoja nefokusuotą fluorescenciją nuo patekimo į detektorių, taip įgalindama optinį pjūvį – gauti ryškius, didelio kontrasto vaizdus nustatytuose gyliuose trimačiame bandinyje. Surinkus optinių pjūvių krūvą skirtingose ​​z padėtyse, galima surinkti visą 3D rekonstrukciją. Konfokalinė mikroskopija plačiai naudojama neuromoksle, vystymosi biologijoje, vėžio tyrimuose ir puslaidininkinių medžiagų analizėje.

4.4 Diferencinio interferencinio kontrasto (DIC) mikroskopija

DIC naudoja poliarizuotą šviesą ir Nomarskio prizmę, kad sukurtų pseudotrimatius skaidrių, nedažytų mėginių, tokių kaip gyvos ląstelės, embrionai ar optiškai lygūs paviršiai, vaizdus, ​​atskleidžiančius paviršiaus topologiją ir vidinius lūžio rodiklio pokyčius su išskirtiniu jautrumu. Tai ypač vertinga gyvų ląstelių vaizdavimui, kai fluorescencinis žymėjimas yra nepageidaujamas arba nepraktiškas.

4.5 Artimųjų infraraudonųjų spindulių (NIR) mikroskopija

Jis veikia maždaug 700 nm ir 1,100 nm bangos ilgiuose. Silicis, kuris yra neskaidrus matomoje šviesoje, šiame diapazone tampa skaidrus, todėl artimojo infraraudonojo spinduliavimo mikroskopija yra nepakeičiama silicio puslaidininkinių įtaisų apžiūrai iš užpakalinės pusės. NIR mikroskopija taip pat naudojama giliųjų audinių vaizdavimui biomedicinos srityje, kur ilgesni bangos ilgiai mažiau sklaidosi ir leidžia gauti didesnį vaizdavimo gylį.

4.6 Artimųjų ultravioletinių (NUV) spindulių mikroskopija

NUV mikroskopija, veikianti bangos ilgiuose nuo 355 nm iki 405 nm, leidžia pasiekti didesnę erdvinę skiriamąją gebą nei matomos šviesos sistemos ir yra plačiai naudojama fotokaukių tikrinimui, UV lazerio mikrogamybos proceso stebėjimui ir puslaidininkių litografijai.

4.7 Ypatingai didelės skiriamosios gebos mikroskopija

Apimanti tokius metodus kaip STED, STORM ir PALM, itin didelės skiriamosios gebos mikroskopija apeina klasikinę difrakcijos ribą ir pasiekia dešimčių nanometrų erdvinę skiriamąją gebą. Šie metodai kelia itin aukštus objektyvo lęšio kokybės reikalavimus, ypač atsižvelgiant į NR, aberacijų korekciją ir perdavimo efektyvumą.

5. Objektyvo vaidmuo

Objektyvas yra bet kurio mikroskopo optinė širdis – čia šviesa labiausiai sąveikauja su mėginiu ir kur nustatomos pagrindinės skiriamosios gebos bei kontrasto ribos. Pasirinkus netinkamą objektyvą, vaizdai tampa neryškūs, signalo ir triukšmo santykis prastas, atsiranda chromatinių artefaktų ir prarandama informacija.

5.1 Apochromatinė korekcija

Apochromatiniai (APO) objektyvai koreguojami trimis ar daugiau bangos ilgių, todėl gaunami plokšti, ryškūs, tikslių spalvų vaizdai visame dominančiame spektriniame diapazone. Tai labai svarbu daugiakanaliam fluorescenciniam vaizdavimui, kai vienalaikis arba nuoseklus kelių bangos ilgių juostų duomenų nuskaitymas turi sukurti kartu registruotus vaizdus be chromatinio poslinkio.

5.2 Begalybės korekcijos optinis dizainas

Begalybės korekcijos sistemoje objektyvas sukuria kolimuotą spindulį tarp savęs ir vamzdinio lęšio. Ši tarpinė kolimuota erdvė leidžia įdėti spindulių daliklius, filtrus, bangolaidžius ir kitus optinius komponentus netrikdant fokusavimo – tai esminis reikalavimas sudėtingoms konfigūracijoms, tokioms kaip fluorescenciniai filtrų kubai, lazerio tiekimo sistemos ir poliarizacijos optika.

6. Wavelength Opto-Electronic Mikroskopo objektyvai

Tyrėjams, inžinieriams ir sistemų integratoriams, kuriems reikalingas tikslumas kiekviename lygmenyje, Wavelength Opto-Electronic siūlo platų daugiau nei 40 mikroskopų asortimentą objektyvus Sukurti griežčiausioms mokslinėms ir pramoninėms reikmėms. Kiekvienas portfelio lęšis sukurtas kaip begalybės korekcijos apochromatinė sistema, veikianti matomoje, artimojoje infraraudonojoje ir nenuolatinėje ultravioletinėje šviesoje.

6.1 M-PlanAPO serija — apochromatiniai begalybės korekcijos objektyvai

Atlieka apochromatinę korekciją visame 400–700 nm matomajame spektre, didinant nuo 1X iki 50X, o skaitinės apertūros diapazonas yra nuo 0.025 iki 0.550. Idealiai tinka realiuoju laiku atliekamam koaksialiniam lazeriniam apdorojimo stebėjimui, mikrovaizdavimui, DIC vaizdavimui, fluorescencijos patikrai biomedicininiuose tyrimuose ir tiksliam jutiklinių skydelių bei saulės elementų lazeriniam remontui.

6.2 M-PlanAPO-HR serija — didelės skiriamosios gebos objektyvai

Dar labiau padidina našumą – NA vertės, siekiančios 0.900 esant 100 kartų didinimui, ir vos 0.30 µm skiriamoji geba. Pasirinkimas toms sritims, kuriose neabejotinas maksimalus erdvinis detalumas, įskaitant pažangų puslaidininkių tikrinimą, nanoskalės paviršių metrologiją ir didelės koncentracijos fluorescencijos patikrą.

6.3 M-PlanAPO-SL serija — itin ilgo darbinio atstumo objektyvai

Skirtas naudoti ten, kur itin svarbus fizinis atstumas tarp objektyvo ir mėginio. SL serijos prietaisai, kurių darbinis atstumas yra iki 30 mm esant 20 kartų didinimui, leidžia vaizduoti per aplinkos kameras, šildomus stalus, mikrofluidinius įrenginius arba individualiai pritaikytus pramoninius korpusus nepakenkiant optinei kokybei.

6.4 NIR objektyvų serija — optimizuota infraraudoniesiems spinduliams

Optimizuotas 532 nm ir 1030–1064 nm bangos ilgiams, specialiai sukurtas silicio plokštelių galinės pusės patikrai, artimojo infraraudonojo spinduliavimo fluorescenciniam vaizdavimui ir femtosekundinio lazerio mikroapdirbimui. M-PlanAPO-HRNIR-50X pasiekia įspūdingą 0.750 NA esant 4 mm darbiniam atstumui, todėl pasižymi išskirtine skiriamąja geba artimojo infraraudonojo spinduliavimo lazerinio apdorojimo taikymams.

6.5 NUV objektyvų serija — optimizuota ultravioletiniams spinduliams

Palaiko 355 nm, 365 nm, 405 nm ir 532 nm bangos ilgius UV fotokaukių patikrai, UV lazerio mikroapdirbimui ir puslaidininkių litografijos stebėjimui. M-PlanAPO-HRNUV-50X užtikrina 0.650 NA ir 10 mm darbinį atstumą – tai derina didelę skiriamąją gebą su praktišku darbiniu atstumu.

6.6 LCD-PlanAPO serija — pataisytas dangtelio stiklas

Suteikia NIR ir NUV objektyvus su integruotomis dengiamojo stiklo korekcijos parinktimis (t0, t0.7 ir t1.1 mm), užtikrinant difrakcijos ribotą našumą vaizduojant per standartinius mikroskopo dengiamuosius stiklelius – tai labai svarbu gyvybės mokslų taikymuose, kai mėginiai įprastai tvirtinami po stikliniais dengiamaisiais stikleliais.

6.7 „PlanFluor-EPI“ serija — fluorescencijai optimizuoti okuliarų objektyvai

Specialiai optimizuotas epiliuminacinei fluorescencinei mikroskopijai, siūlantis iki 0.90 NA vertes esant 100X padidinimui ir 25 mm lauko numeriui. Galima įsigyti su W4/5″ ir M26 x 0.706 sriegių formatais, kad būtų suderinamas su įvairiomis vertikaliomis ir apverstomis fluorescencinių mikroskopų platformomis.

6.8 TL-200-70 vamzdinis lęšis

Sukurtas naudoti su bet kuriuo iš aukščiau paminėtų begalybės korekcijos objektyvų, TL-200-70 (EFL: 200 mm, WD: 60.36 mm) sufokusuoja kolimuotą išėjimo spindulį į ryškų, gerai pakoreguotą tarpinį vaizdą su minimalia aberacija, taip užbaigdamas optinę sistemą.

Originalios įrangos gamintojų (OEM) klientams ir mokslinių tyrimų įstaigoms, kuriems reikalingos individualios specifikacijos, galima pritaikyti visą asortimentą pagal užsakymą, įskaitant modifikuotus darbinius atstumus, specializuotas dangas, alternatyvius siūlų formatus arba visiškai individualius optinius dizainus. Susisiekite su mumis ir aptarkite savo reikalavimus.

7. Tinkamo objektyvo pasirinkimas

Optimalaus tikslo pasirinkimas reikalauja kruopščiai suderinti kelis parametrus su konkrečia jūsų taikymo sritimi ir sistemos projektu.

7.1 Bangos ilgių diapazonas

Nustatykite, ar jūsų taikymas veikia matomoje, artimojoje infraraudonojoje (NIR), ar neultravioletinėje (NUV) spektro srityje, ir pasirinkite objektyvą, kurio stiklas ir dangos yra optimizuoti šiam diapazonui.

7.2 Didinimas ir NA

Didesnis didinimas ir NA suteikia geresnę skiriamąją gebą, bet sumažina matymo lauką ir darbinį atstumą. Pirmiausia apibrėžkite savo skiriamosios gebos reikalavimus, tada pasirinkite mažiausią juos atitinkantį didinimą.

7.3 Darbinis atstumas

Įvertinkite mėginio ir mėginio laikiklio geometriją. Uždaroms kameroms, storiems pagrindams arba pramoninėms sistemoms paprastai reikalingi dideli darbiniai atstumai.

7.4 Dengiamojo stiklo korekcija

Jei vaizduojama per dengiamojo stiklelio storį, naudokite LCD serijos koreguotą objektyvą, atitinkantį dengiamojo stiklelio storį, kad išvengtumėte sferinės aberacijos sukelto vaizdo pablogėjimo.

7.5 Taikymo aplinka

Apsvarstykite, ar objektyvas bus naudojamas švarioje laboratorijoje, pramoninėje gamybos linijoje ar lazerinio apdorojimo darbo stotyje, nes tai turi įtakos reikiamam mechaniniam tvirtumui ir atsparumui užteršimui.

8. Tiksliosios mikroskopijos taikymas

8.1 Biomedicinos ir gyvybės mokslai

Apochromatiniai objektyvai su dideliu NA yra standartinė priemonė ląstelių biologijoje, patologijoje, genomikoje ir farmacijos vaistų kūrime. Daugiakanalis fluorescencinis ir konfokalinis vaizdavimas naudojant M-PlanAPO ir PlanFluor-EPI serijas palaiko sudėtingiausius biologinio vaizdavimo darbo eigą.

8.2 Puslaidininkių ir plokštelių apžiūra

NIR objektyvai leidžia apžiūrėti silicio įtaisus iš užpakalinės pusės esant 1064 nm bangos ilgiui, kur silicis yra skaidrus, taip atskleidžiant paslėptus sujungimus, tuštumas ir defektus, nematomus matomos šviesos sistemoms. M-PlanAPO-NIR ir HRNIR serijos yra specialiai sukurtos šiam tikslui.

8.3 Lazerinis mikrogaminimas ir apdorojimas

Tiksliam lazeriniam pjovimui, gręžimui, suvirinimui ir paviršiaus struktūrizavimui mikronų mastu reikalingi objektyvai su tiksliu spindulio fokusavimu, dideliais darbiniais atstumais ir didelėmis lazerio pažeidimo ribomis. M-PlanAPO-SL ir NIR serijos yra optimizuotos bendraašiam lazerio tiekimui ir procesų stebėjimui realiuoju laiku.

8.4 Teisinių ir istorinių dokumentų analizė

Didelio darbinio atstumo objektyvai su matomumo ir artimojo infraraudonųjų spindulių spektro galimybėmis leidžia bekontakčiu būdu vaizduoti trapius istorinius dokumentus, meno kūrinius ir teismo ekspertizės įrodymus – atskleisti paslėptą tekstą, rašalo sudėtį ir klastojimo pėdsakus be fizinio kontakto ar žalos rizikos.

8.5 Medicininis optinis vaizdavimas

Nuo endoskopijos iki oftalmologijos ir chirurginio konsultavimo – tikslumas objektyvus leidžia atlikti didelės skiriamosios gebos in vivo vaizdavimą įvairiais medicinos metodais. Wavelength Opto-ElectronicObjektyvo diapazonas atitinka įvairių medicininių vaizdavimo sistemų architektūrų optinius reikalavimus.

9. Išvada

Mikroskopija yra daug daugiau nei vien didinimas. Tai mokslas apie aiškų matymą – tiksliai, tam tikru masteliu ir per visą bangos ilgių spektrą – ir tai, kas matoma, paverčiama žiniomis ir gebėjimais. Kiekviena mikroskopijos pažanga atvėrė naujus langus į fizinį pasaulį – nuo ​​ląstelės atradimo iki atskirų atomų vaizdavimo, nuo nanoskalės tranzistorių tyrimo iki gyvos neuroninės veiklos vizualizavimo.

Jis išlieka pagrindiniu optiniu elementu šioje srityje. Jo skaitinė diafragma nustato skiriamosios gebos lubas. Spektrinė korekcija lemia chromatinę tikslumą. Darbinis atstumas apibrėžia, kokie pavyzdžiai ir konfigūracijos yra prieinami. O aberacijų korekcija atskiria publikuotinus duomenis nuo artefaktų kupino triukšmo.

Nesvarbu, ar kuriate fluorescencinio vaizdavimo platformą gyvybės mokslams, artimojo infraraudonojo spinduliavimo (NIR) patikros sistemą puslaidininkių kokybės kontrolei, ar UV lazerinio apdorojimo darbo stotį tiksliajai gamybai, objektyvas yra vieta, kur laimi arba pralaimi našumas. Wavelength Opto-ElectronicDaugiau nei 40 mikroskopo objektyvų lęšių asortimentas – apimantis matomos, artimosios infraraudonosios ir neautentiškos šviesos spektro juostas, standartinius, didelės skiriamosios gebos, didelio darbinio atstumo ir dengiamojo stiklo korekcijos variantus – suteikia optinį pagrindą reikliausioms mikroskopijos reikmėms tyrimuose ir pramonėje.